Berikut ini contoh "Laporan Praktikum Kimia Organik: Isolasi dan Analisis Pigmen dari Tumbuhan" beserta pembahasannya. Semoga bermanfaat dan menambah pengetahuan kita semua... Amin...
Isolasi dan Analisis Pigmen dari Tumbuhan
Dimas Prasetyo
12/345678/910/111213
Intisari
Telah dilakukan percobaan isolasi dan analisis pigmen dari tumbuhan dengan tujuan melakukan isolasi senyawa bahan alam, melakukan thin layer chromatography (TLC), mengoprasikan Spektrofotometri UV-Vis, dan melakukan kromatografi kolom.
Daun ketela segar yang dihaluskan ditambahkan dengan aseton dan diambil ekstraknya untuk diukur absorbansi dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 661,6 nm; 644,8 nm; dan 410 nm. Sisa ekstrak diisolasi dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut n-heksana dan akuades. Pemisahan pigmen dengan kromatografi kolom menggunakan eluen n-heksana, n-heksana/aseton (7/3), aseton, dan aseton/metanol (80/20). Tiap fraksi lalu diuji dengan TLC menggunakan pelarut n-heksana/aseton (7/3).
Konsentrasi klorofil a pada sampel yaitu 23,37 μg/mL. Konsentrasi klorofil b yaitu 8,71 μg/mL, dan konsentrasi karotenoid yaitu 544,3 μg/mL. Menurut hasil analisis dengan TLC, diketahui sampel memiliki pigmen xantofil, klorofil a, klorofil b, dan β-karoten.
Kata kunci: ekstraksi, kromatografi, pigmen
Isolasi dan Analisis Pigmen dari Tumbuhan
I. Tujuan
1. Melakukan isolasi senyawa bahan alam
2. Melakukan Thin Layer Chromatography (TLC)
3. Mengoprasikan Spektrofotometri UV-Vis
4. Melakukan kromatografi kolom.
II. Dasar Teori
Isolasi adalah cara pemisahan komponen-komponen kimia yang terdapat dalam suatu bahan alam. Langkah pertama yang biasanya dilakukan didalam isolasi senyawa organik bahan alam adalah ekstraksi sampel menggunakan pelarut organik. Ada beberapa metode ekstraksi sampel bahan alam, antara lain maserasi, infundasi, digesti, perkolasi, dan soxletasi. Langkah berikutnya setelah diperoleh ekstrak dalam isolasi senyawa bahan alam adalah pemisahan komponen-komponen yang terdapat dalam ekstrak tersebut. Teknik yang digunakan adalah kromatografi. Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Beberapa teknik kromatografi yang banyak digunakan antara lain Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Kolom Vakum (KVC), Kromatografi Kolom Gravitasi (KG), dan Kromatotron (Atun, 2014).
Pigmen tumbuhan ditemukan dalam plastida dan vakuola. Ada bermacam-macam pigmen tumbuhan, misalnya klorofil (pigmen hijau) didalam kloroplas dan karotenoid (pigmen kuning-merah) didalam kromoplas yang tidak mempunyai klorofil atau hanya mengandung sedikit klorofil. Kelompok pigmen lain adalah flavonoid (antosianin dan flavon atau flavonol) yang biasanya terdapat didalam vakuola, khususnya pada bunga dan buah dengan berbagai warna (Mulyani, 2006).
Klorofil adalah pigmen pemberi warna hijau pada tumbuhan, alga, dan bakteri fotosintetik. Pigmen ini berperan dalam proses fotosintesis tumbuhan dengan menerap dan mengubah energi cahaya menjadi energi kimia. Tanaman tingkat tinggi mempunyai dua macam klorofil yaitu klorofil a (C55H72O5N4Mg) yang berwarna hijau tua dan klorofil b (C55H70O6N4Mg) yang berwarna hijau muda. Klorofil a dan klorofil b paling kuat menyerap cahaya dibagian merah (600-700 nm) dan paling sedikit menyerap cahaya hijau (500-600 nm) (Ai dan Banyo, 2011).
Spektrofotometer UV-Vis digunakan untuk mengukur absorbansi spektrum daerah UV dan Visible. Instrumen ini merupakan bentuk colorimeter yang dapat menyediakan cahaya monokromatis. Prisma akan memecah cahaya menjadi komponen warna dan dapat langsung menjadi cahaya monokromatis dari larutan sampel yang dianalisis. Sorotan cahaya mengandung kekuatan foton. Saat foton mengenai molekul analit, analit akan mengadsorp foton, sehingga jumlah foton berkurang (Nair, 2007).
Kromatografi Lapis Tipis berprinsip dimana suatu analit bergerak melintasi lapisan fase diam dibawah pengaruh fase gerak, yang bergerak melalui fase diam. Semakin polar suatu senyawa fase gerak, semakin besar partisi ke dalam fase diam gel silika, semakin sedikit waktu yang dibutuhkan fase gerak untuk bergerak menyusuri plat sehingga semakin pendek jarak tempuh senyawa tersebut menaiki plat dalam waktu tertentu (Watson, 2005).
Sampel diteteskan didekat salah satu sisi plat dalam bentuk larutan dengan jumlah kecil. Noda sampel dikeringkan dan sisi plat dicelupkan ke dalam fase gerak yang sesuai. Pelarut bergerak naik disepanjang lapisan tipis zat padat diatas plat, dan bersamaan dengan pergerakan pelarut tersebut, zat terlarut sampel dibawa dengan laju yang tergantung pada kelarutan zat terlarut tersebut dalam fase gerak dan interaksinya dengan zat padat (Day, 1980).
Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang menggunakan zat penyerap (fase diam) dalam wadah kaca berbentuk buret, fase gerak dituangkan diatas dan menetes dibawah (Pudjaatmaka, 2002). Dalam kromatografi kolom, fase diam ditempatkan dalam kolom yang dilewati fasa gerak yang dipengaruhi oleh adanya tekanan gravitasi (Harvey, 2000).
III. Metode Percobaan
III.1 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu cawan porselin, pipet pasteur, kapas, gelas beaker, gelas ukur, ependof, plat KLT, pipet tetes, pengaduk gelas, 1 set alat kromatografi kolom, spektrometer UV-Vis, tabung reaksi, alat kromatografi lapis tipis, dan chamber.
Bahan yang digunakan yaitu daun ketela segar, larutan aseton, Na2SO4 anhidrat, larutan n-heksana, akuades, dan larutan metanol.
III.2 Cara Kerja
Pada proses ekstraksi 3 gram daun ketela segar dihaluskan di cawan porselin lalu ditambahkan 10 mL aseton. Ekstrak disaring dengan pipet pasteur yang ujungnya telah diberi kapas dan Na2SO4 anhidrat. Ekstrak kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi kecil dan diambil 0,5 mL untuk diukur absorbansinya dengan alat spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 661,6 nm; 644,8 nm; dan 470 nm. Sisa ekstrak yang ada dilarutkan ke dalam 6 mL larutan n-heksana dan 6 mL larutan akuades pada tabung gelas reaksi lalu dikocok dan diambil fasa organiknya. Fasa organik tersebut adalah ekstrak pigmen.
Pada proses pemisahan pigmen dengan kromatografi kolom, kolom dicuci dahulu dengan 1 mL larutan n-heksana. Saat pelarut hampir rata dengan ujung atas pelarut, ekstrak pigmen dimasukkan ke dalam kolom. Lalu kolom dielusikan dengan 5 mL n-heksana, 5 mL n-heksana/aseton (7/3), 5 mL aseton, dan 5 mL aseton/metanol (80/20) berturut-turut. Tiap eluat ditampung dalam ependof dengan fraksi tiap 1 mL. Setiap fraksi diuji dengan kromatografi lapis tipis termasuk ekstrak yang diuji dengan spektrofotometer UV-Vis. Campuran larutan n-heksana/aseton (7/3) sebanyak 10 mL dimasukkan ke dalam chamber diikuti dengan masuknya plat KLT. Kemudian noda pada plat dilihat pada sinar UV 254 nm dan noda ditandai dengan pensil, lalu dihitung nilai Rf.
IV. Hasil dan Pembahasan
Percobaan isolasi dan analisis pigmen dari tumbuhan terbagi menjadi empat bagian percobaan yaitu isolasi bahan alam dengan metode ekstraksi , penentuan konsentrasi pigmen dengan alat spektrometer UV-Vis, pemisahan pigmen dengan kromatografi kolom, dan pemisahan serta penentuan pigmen dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Tumbuhan yang digunakan pada percobaan ini adalah daun ketela segar, dimana tulang daun telah dibuang terlebih dahulu karena pada umumnya pigmen terdapat pada lembaran daun. Pigmen tumbuhan dapat diisolasi melalui penumbukan daun ketela hingga halus. Metode ini dipilih karena pigmen dapat keluar dengan mudah yang selanjutnya dapat diikat dengan pelarut tertentu. Dalam percobaan ini, aseton digunakan untuk mengikat dan memisahkan pigmen dari jaringan daun ketela penggunaan aseton berdasarkan prinsip “like dissolve like” karena aseton termasuk dalam pelarut polar yang kepolarannya masih dibawah metanol, sehingga diharapkan aseton dapat mengekstraksi pigmen tumbuhan yang kepolarannya mirip.
Selanjutnya ekstrak pigmen disaring dengan kapas dan Na2SO4 anhidrat. Adanya kapas berfungsi untuk menyaring pigmen dalam ekstrak sehingga nantinya akan didapat ekstrak pigmen daun ketela tanpa pengotor dalam ukuran besar. Sedangkan penambahan Na2SO4 anhidrat adalah untuk menyerap air dalam ekstrak. Air harus dihilangkan dari ekstrak pigmen daun ketela karena air dapat mempengaruhi hasil kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kolom. Hal ini dikatenakan KLT dan kromatografi kolom didasarkan pada distribusi senyawa berdasarkan kelarutannya.
Ekstrak pigmen yang diperoleh ditentukan konsentrasinya melalui pengukuran absorbansi dengan menggunakan instrumen spektrofotometer UV-Vis. Analisis ini dapat dilakukan karena pigmen daun yang kebanyakan berupa klorofil dan karotenoid dimana keduanya termasuk senyawa kompleks yang tingkat energinya tidak terlalu tinggi dibandingkan pada molekul/senyawa sederhana sehingga foton yang berasal dari daerah UV dan sinar tampak dapat mempengaruhi transisi elektron. Nilai absorbansi pigmen dapat diukur karena pigmen yang merupakan zat warna dapat menyerap cahaya tampak dan gugus yang berperan dalam penyerapan ini adalah gugus kromofor.
Ekstrak pigmen dianalisis pada panjang gelombang 661,6 nm; 644,8 nm; dan 470 nm. Ketiga panjang gelombang tersebut dipilih karena klorofil a dan klorofil b paling kuat menyerap cahaya dibagian merah (600-700 nm), sedangkan karotenoid paling kuat menyerap cahaya dibagian biru (450 nm). Berikut hasil yang diperoleh:
Λ (nm)
|
A
|
661,6
|
2,241
|
644,8
|
0,893
|
470
|
1,759
|
Berdasarkan data tersebut dapat dihitung nilai konsentrasi klorofil a adalah 23,37 μg/mL; klorofil b adalah 8,71 μg/mL; dan konsentrasi karotenoid total yaitu 544 μg/mL. Melalui hasil perhitungan konsentrasi tersebut dapat diketahui bahwa pada daun ketela mengandung pigmen yang sangat tinggi jika dibandingkan klorofil.
Tahap selanjutnya adalah pemisahan pigmen dengan kromatografi kolom. Ekstrak aseton yang telah diperoleh sebelumnya ditambahkan ke dalam campuran n-heksana dan akuades lalu dikocok dan diambil fasa organiknya. Fasa organik akan terdistribusi dalam pelarut n-heksana. Sedangkan komponen polar atau komponen yang mengandung air akan terdistribusi pada fasa air. Pigmen yang dianalisis diharapkan terdistribusi dalam fasa nonpolar (n-heksana) karena adanya perbedaan polaritas. Sehingga ekstraksi dengan n-heksana dan akuades dilakukan untuk memisahkan pigmen dari air.
Selanjutnya kolom yang telah disiapkan dicuci dengan n-heksana. Saat pelarut hampir rata, ujung kolom dimasukkan ekstrak pigmen. Ekstrak kemudian dielusi dengan eluen pertama yaitu n-heksana, eluen kedua yaitu campuran n-heksana/aseton (7/3), eluen ketiga yatu aseton, dan eluen terakhir adalah campuran aseton/ metanol (8/2). Jika diamati eluen yang digunakan berturut turut mulai dari eluen yang bersifat nonpolar (n-heksana), kemudian menjadi semakin polar, hingga sampai eluen (aseton/metanol- 8/2) yang paling polar untuk melarutkan komponen-komponen dalam ekstrak sesuai dengan tingkat kepolarannya. Berikut adalah eluat yang diperoleh:
Dari 22 eluat yang diperoleh, dipilih beberapa eluat yang dapat merepresentasikan tiap penambahan eluen lalu dianalisis dengan KLT. Berikut adalah nilai Rf teoritis untuk pigmen tumbuhan.
Rf
|
Pigmen
|
0,16
|
Xantofil (kuning)
|
0,32
|
Klorofil b (hijau muda)
|
0,44
|
Klorofil a (hijau tua)
|
0,95
|
Β-karoten (merah-jingga)
|
0,49
|
Feofitin b (coklat kekuningan)
|
0,6
|
Feofitin a (hijau kecoklatan)
|
(Griffin etc., 2004)
Plat 0 yang merupakan plat yang ditetesi dengan ekstrak bahan analisa dengan sinar UV memiliki tujuh moda. Nilai Rf dari tujuh noda tersebut yaitu 0,07 dan 0,17 yang diasumsikan sebagai xantofil; 0,32 yang diasumsikan sebaai klorofil b; 0,47 dan 0, 52 yang diasumsikan sebagai klorofil a; dan 0,95 yang diasumsikan sebagai Β-karoten. Fraksi yang berwarna hijau tua menunjukkan klorofil a banyak terisolasi pada ekstrak ini.
Selanjutnya plat kedua ditetesi fraksi nomor 2 hasil kromatografi kolom dengan eluen n-heksana. Larutan n-heksana merupakan non-polar sehingga nantinya senyawa non-polar akan terelusi dari kolom seperti pada fraksi nomor 0. Plat 2 menunjukkan 1 noda dengan nilai Rf 0,94. Nilai Rf tersebut menunjukkan senyawa Β-karoten adalah senyawa paling non-polar dalam fraksi 2. Fraksi ini berwarna kuning sesuai teori yang menyatakan Β-karoten berwarna merah-jingga.
Proses selanjutnya yang dianalisis yaitu plat yang ditetesi fraksi 7, hasil kromatografi kolom dengan eluen campuran n-heksana/aseton (7/3). Eluen n-heksana bersifat non-polar dan aseton bersifat polar. Tetapi ketika disinari dengan UV tidak terlihat ada noda yang terbentuk. Artinya dalam fraksit tersebut tidak terkandung pigmen.
Plat keempat yang dianalisis adalah plat yang ditetesi fraksi 11. Fraksi 11 merupakan eluat hasil kromatografi kolom dengan eluen aseton. Selain fraksi 11 fraksi lain yang dianalisis dengan KLT dan menggunakan eluen yang sama yaitu fraksi 12, fraksi 16, dan fraksi 18. Eluen aseton termasuk senyawa semi polar, yang tingkat kepolarannya dibawah metanol. Plat 11 memiliki 2 noda dengan nilai Rf 0,41 dan 0,55 yang diasumsikan sebagai korofil a yang berwarna hijau tua sesuai dengan warna eluat yang diperoleh.
Plat fraksi 12 memiliki 3 noda dengan nilai Rf sebesar 0,4; 0,46; dan 0,58 yang juga diasumsikan sebagi klorofil a karena klorofil a merupakan zat warna hijau tua dan warna eluat yang diperoleh juga hijau tua. Selanjutnya fraksi 16 memiliki warna lebih muda daripada fraksi 11 dan 12. Plat fraksi 16 memiliki nilai Rf 0,39 dan 0,44 yang diasumsikan sebagai klorofil b dan sebagai klorofil a. Adanya klorofil b sebagai zat warna hijau muda dimungkinkan membuat fraksi 16 berwarna lebih muda dibandingkan fraksi 11 adan 12.
Selanjutnya plat fraksi 18 memiliki 3 noda dengan nilai Rf 0,38 yang diasumsikan sebagai klorofil b dan nilai Rf 0,94 serta 0,99 yang diasumsikan sebagai senyawa Β-karoten. Adanya senyawa Β-karoten sebagai zat warna merah-jingga membuat fraksi 18 berwarna hijau muda dan sedikit kekuningan. Klorofil dan Β-karoten yang dapat terelusi oleh aseton dimungkinkan karena kedua senyawa tersebut adalah senyawa semi polar sehingga dapat diikat oleh senyawa polar maupun senyawa non-polar.
Plat yang terakhir yaitu plat yang ditetesi fraksi 20 dimana fraksi 20 merupakan eluat hasil kromatografi kolom dengan eluen berupa campuran aseton dan metanol (80/20). Eluat yang terpisah bersifat relatif lebih polar. Plot fraksi 20 menghasilkan 2 noda yaitu noda dengan nilai Rf 0,89 dan 0,96 yang diasumsikan sebagai Β-karoten. Eluat yang dihaslkan berwarna hijau muda sedikit kekuningan karena adanya Β-karoten sebagai zat warna merah-jingga.
Kromatografi kolom yang dilakukan diikuti KLT karena ada kromatografi kolom yang digunakan pada percobaan ini hanya dapat digunakan untuk pemisahan tanpa identifikasi. Kromatografi kolom yang dilakukan tergolong kromatografi kolom konvensional karena tidak dilengkapi detektor untuk deteksi serta identifikasi komponen. Sehingga dilakukan dengan TLC untuk identifikasi karena relatif mudah dilakukan,
Plat TLC yang digunakan pada percobaan ini bertindak sebagai fasa diam dan campuran n-heksana/aseton (7/3) bertindak sebagai fase gerak. Perbandingan larutan n-heksana lebih tinggi karena sebagian besar komponen pada pigmen daun ketela adalah non-polar. Hal ini sesuai dengan prinsip ‘like dissolve like” dimana n-heksana yang merupakan senyawa non-polar akan mengikat senyawa pigmen daun ketela yang bersifat non-polar. Sehingga komponen non-polar dapat terdistribusi didalam fase gerak dan terpisahkan dengan bagian polar.
Ekstrak yang diperoleh diteteskan pada plat KLT menggunakan pipet kapiler sehingga volume sampel relatif sedikit. Hal ini dilakukan untuk reprodusibilitas data. Jika volume yang diteteskan terlalu banyak maka akan muncul “ekor”. Munculnya “ekor” atau tailing disebabkan oleh afinitas zat fasa diam lebih besar dibandingkan dengan kemampuan fase gerak untuk membawa komponen zat yang akan mengakibatkan banyak bagian tertinggal difasa diam.
Selanjutnya plat diletakkan didalam chamber dengan posisi tegak agar fase gerak dapat naik sepanjang plat dengan baik. Apabila komponen dalam fraksi eluat memiliki kepolaran yang sama dengan fase gerak yang lebih tinggi perbandingan non-polarnya maka komponen tersebut akan memiliki afinitas yang kuat dengan fasa gerak. Sehingga jarak yang akan ditempuh oleh komonen lebih besar dan menghasilan nilai Rf yang lebih besar. Begitu pula sebaiknya.
Ada beberapa nilai Rf yang tidak tepat sesuai dengan teoritis dikarenakan sampel yang digunakan untuk percobaan berbeda. Jadi pigmen yang terdapat pada daun ketela jika dianalisis nilai Rf dan warna yang dihasilkan adalah sebagai berikut
a) Xantofil
b) Β-karoten
c) Klorofil a
d) Klorofil b
V. Kesimpulan
- Isolasi dan analisis bahan alam yang digunakan adalah daun ketela melalui proses ekstraksi, kromatografi, serta spektrometri.
- Melalui metode kromatografi lapis tipis dapat diperoleh pemisahan komponen pigmen yang sempurna
- Menggunakan spektrometer UV-Vis diperoleh hasil konsentrasi klorofil a sebesar 23,37 μg/mL, konsentrasi klorofil b sebesar 8,71 μg/mL, dan konsentrasi karotenoid total sebesar 544,3 μg/mL.
- Melalui metode kromatografi kolom yang diikuti identifikasi dengan TLC diperoleh hasil pigmen yang terkandung didalam daun ketela yaitu xantofil, β-karoten, klorofil a, dan klorofil b.
VI. Daftar Pustaka
Ai, N.S, dan Banyo, Yunia, 2011, Konsentrasi Klorofil Daun Sebagai Indikator Kekurangan Air pada Tanaman, Jurnal Ilmiah Sains, Vol. 11, No.2, 167-168
Atun, Sri, 2014, Metode Isolasi dan Identifikasi Struktur Senyawa Organik Bahan Alam, Journal Konservasi Cagar Budaya Borobudur, Vol.8, No.2, 55-56
Day, R.A., 1980, Analisis Kimia Kuantitatif, PT. Gelora Aksara Pratama, Jakarta
Griffin, G.W., Quach, H.T., and Steeper, Robert L., 2004, Extraction and Thin Layer Chromatography of Chlorofhyll A and B from Spinach, Journal Chem Ed., 81, 385-387
Harvey, D., 2000, Modern Analytical Chemistry, The McGraw-Hill Companies Inc. USA
Mulyani, s., 2006, Anatomi Tumbuhan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta
Nair, A.J., 2007, Principle of Biotechnology, Laxmi Publications, New Delhi
Pudjaatmaka, A.H., 2002, Kamus Kimia, Balai Pustaka, Jakarta
Watson, D., 2005, Analisis Farmasi, Edisi kedua, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta
VII. Lembar Pengesahan
Yogyakarta, 1 Agustus 2016
Asisten Pembimbing Praktikan
(Nama Asisten) (TS)
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Lampiran
Perhitungan Konsentrasi Pigmen:
Absorbansi pada 661,6 nm = 2,241
Absorbansi pada 644,8 nm = 0,893
Absorbansi pada 470 nm = 1,759
Konsentrasi Klorofil a (Ca) = {11,24 x (A661,6) – 2,04 x (A644,8)} μg/mL
= {11,24 x (2,241) – 2,04 x (0,893)} μg/mL
= {25,19 – 1,82} μg/mL
= 23,37 μg/mL
Konsentrasi Klorofil b (Cb) = {20,13 x (A644,8) – 4,19 x (A661,6)} μg/mL
= {20,13 x (0,893) – 4,19 x (2,241)} μg/mL
= {18,1 – 9,39} μg/mL
= 8,71 μg/mL
Konsentrasi Klorofil Total (Ca + Cb) = {7,05 x (A661,6) + 18,09 x (A644,8)} μg/mL
= {7,05 x (2,241) + 18,09 x (0,893)} μg/mL
= {15,8 + 16,2} μg/mL
= 32 μg/mL
Konsentrasi Karotenoid Total (Cx+c) = [{1000 x (A470) – 1,90 x Ca - (63,14 Cb)}/ 2,14] μg/mL
= [{1000 x (1,759) – 1,90 x 23,37 - (63,14 x 8,71)}/ 2,14] μg/mL
= [{1759 – 44,4 – 549,9}/2,14] μg/mL
= [{1164,7}/2,14] μg/mL
= 544,3 μg/mL
Tidak ada komentar:
Posting Komentar