Analisis Vitamin C Menggunakan HPLC
Dimas Prasetyo
12/345678/910/111213
Intisari
Percobaan Analisis Vitamin C Menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ini bertujuan agar praktikan dapat mempelajari alat HPLC dan juga dapat melakukan analisis vitamin C dalam jus buah jeruk dengan HPLC.
Proses analisis kadar vitamin C atau asam askorbat dilakukan dengan cara buah jeruk diperas dan disaring untuk diperoleh sampel jus jeruk. Sampel jus jeruk kemudian diencerkan 1000 kali. Larutan standar asam askorbat dibuat 0,001%; 0,002%; 0,004%, dan 0,008%. Sampel jus buah dan standar dianalisis dengan HPLC. Konsentrasi asam askorbat dalam sampel dapat dihitung dengan bantuan data kurva kalibrasi larutan standar.
Berdasarkan hasil percobaan dan pengolahan data, didapatkan hasil persamaan kurva kalibrasi adalah y= 1.109x + 263398 dengan nilai R2= 0,9755. Sehingga dapat diketahui kadar asam askorbat dalam jeruk adalah 753,21 mg/100 gr jeruk.
Kata kunci: asam askorbat, HPLC, standar eksternal
I. Tujuan
II. Tinjauan Pustaka
III. Metode Percobaan
IV. Hasil Percobaan dan Pembahasan
(Nama Asisten) (TS)
Analisis Vitamin C Menggunakan HPLC
1. Mempelajari cara kerja alat HPLC
2. Melakukan analisis vitamin C dalam jus buah jeruk dengan HPLC
II. Tinjauan Pustaka
Kromatografi adalah teknik analisis pemisahan molekul berdasarkan perbedaan struktur dan/atau komposisi. Umumnya, kromatografi melibatkan pergerakan sampel dalam sistem melewati fasa diam (stationary phase). Molekul- molekul dalam sampel akan memiliki perbedaan afinitas dan interaksi dengan fase diam yang mengakibatkan pemisahan molekul-molekul tersebut yang ada dalam sampel. Komponen/ molekul sampel yang berinteraksi dengan fasa diam lebih kuat, akan bergerak lebih lambat didalam kolom dibandingkan dengan komponen yang berinteraksi lebih lemah. Pemisahan kromatografi dapat dilakukan dengan variasi fasa diam, termasuk silika dalam plat gelas (Thin Layer Chromatography), gas volatil (Gas Chromatography), kertas (Paper Chromatography), dan cairan (Liquid Chromatography) (Kupiet, 2004).
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) adalah teknik kromatografi cair yang dilakukan untuk memisahkan dan mengukur senyawa yang telah dilarutkan dalam suatu larutan. HPLC digunakan untuk menentukan jumlah dari suatu senyawa spesifik dalam suatu larutan. Berikut dibawah ini merupakan skema alat dari HPLC:
(Gambar 1: skema alat HPLC)
Sistem yang digunakan pada kromatografi, seringnya dikatagorikan dalam empat tipe berdasarkan proses mekanisme pemisahannya, yaitu adsorpsi, partisi, ion-exchange, dan size exclusion (ukuran). Dalam skema proses kromatografi, proses terpenting ada pada bagian kolom dimana terjadinya proses pemisahan komponen dari sampel. Karena fase diam tersusun dari partikel dengan pori mikro, maka tekanan yang tinggi dibutuhkan dari pompa dibutuhkan untuk menggerakkan fase gerak melewati kolom. Setap komponen yang terelusi dari kolom akan muncul sebagai peak (puncak) pada tampilan data (Kupiet, 2004).
Asam askorbat adalah agen pereduksi yang kuat. Penelitian pada interaksi dari asam askorbat dengan bervariasi ion logam dan bahan kimia, mengindikasikan bahwa asam askorbat dan produk oksidasinya yaitu asam dehidroaskorbat dan juga intermediet asam monodehidroaskorbat bebas radikal, dapat berfungsi sebagai pasangan redoks dalam reaksi yang melibatkan transfer elektron dan potensi membran elektrokimia. Penelitian interaksi antara asam askorbat ekstraseluler dengan variasi protein membran plasma, mengacu pada asam askorbat dapat berfungsi sebagai neuromodulator. Dalam variasi dari fungsi lain asam askorbat di dalam metabolisme sel dapat diperhitungkan dikarenakan sifat pereduksinya yang mana dapat melindungi komponen sel dari kerusakan oksidatif. Perannya sebagai penyapu untuk mengoksidasi radikal bebas dan spesi turunan oksigen yang berbahaya seperti radikal hidroksi, hidrogen peroksida, dan oksigen singlet. Reaksi biokimia tertentu diketahui terstimulasi oleh aktivitas prooksidan dari asam askorbat. Aktifiats antibacterial dan antiviral dari asam askorbat dalam larutan berair mungkin disebabkan oleh sifat prooksidan ini (Aysun, 2009).
Asam askorbat memiliki rumus molekul C6H8O6 dengan berat molekul 176,13 dan titik leleh 190- 192°C. Zat ini memiliki bentuk serbuk kristal berwarna putih, memiliki kelarutan 33 g/100mL H2O dan 2 g/100mL etanol setra 1 g/100mL gliserol. Selain itu, 2% larutan berairnya memiliki pH 2,4- 2,8, absorbansi pada 589 nm, dan memutar bidang cahaya terpolarisasi sejauh +20,8° hingga 21,5° (Hudson, 1990).
Asam askorbaat memiliki struktur sebagai berikut:
(Gambar 2: stuktur asam askorbat)
(Crans et. al., 2008)
Jeruk adalah salah satu dari buah dan sayur tropis yang memiliki kandungan asam askorbat/ vitamin C yang tinggi. Karena mengandung senyawa asam, jeruk juga memiliki rasa masam. Berdasarkan salah satu jurnal hasil penelitian, kadar asam askorbat dalam jeruk adalah sekitar 984,80 mg/100 g jeruk (Dumbrava et al., 2012).
III. Metode Percobaan
1. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada percobaan ini antara lain labu takar 50 dan 100 mL, tabung ependof 1,5 mL, neraca analit, pipet ukur 1 mL, gelas ukur 100 mL, pipet tetes, penyaring, dan alat HPLC.
Bahan yang digunakan pada percobaan ini antara lain sampel buah jeruk, larutan standar asam askorbat, serta akuades.
2. Cara Kerja
Sampel buah jeruk dikupas dan diambil sebagian untuk ditimbang, lalu diperas dan disaring hingga didapat sampel jus jeruk maksimal. Jus yang didapat diukur volumenya. Sampel jus diambil 1 mL untuk kemudian diencerkan 1000 kali. Jus yang sudah encer diambi 1 mL lalu dimasukkan ke dalam tabung ependof.
Proses selanjutnya adalah pembuatan larutan standar asam askorbat. Sebanyak 50 mL larutan standar asam askorbat 0,1% b/v disiapkan. Kemudian larutan standar ini diencerkan menjadi 0,001%; 0,002%; 0,004%, dan 0,008%. Proses selanjutnya, larutan sampel dan larutan standar dianalisis dengan alat HPLC. Kemudian kadar sampel dihitung dari data kurva kalibrasi data kromatogram Luas Area dibanding Konsentrasi larutan kurva standar.
IV. Hasil Percobaan dan Pembahasan
1. Hasil Percobaan
No
|
Luas Area
|
% b/v
|
1
|
1482510
|
0,001
|
2
|
2041249
|
0,002
|
3
|
4479473
|
0,004
|
4
|
1520666
|
0,001257 (sampel)
|
2. Pembahasan
Percobaan kali ini, praktikan melakukan analisis asam askorbat dalam buah jeruk menggunakan metode HPLC. Dengan melakukan percobaan ini, praktikan diarahkan agar dapat memahami cara kerja alat HPLC dan juga dapat melakukan analisis kadar vitamin C dalam suatu sampel menggunakan HPLC. HPLC sendiri adalah salah satu jenis dari kromatografi cair yang memiliki senstitvitas yang tinggi dalam menganalisis kadar suatu senyawa dalam sampel.
Percobaan kali ini dilakukan dengan mengambil sampel jeruk. Sampel jeruk ini lalu diperas dan disaring untuk mendapatkan jusnya. Jus jeruk yang diperoleh sebanyak 21,5 mL, lalu diambil 1 mL dan diencerkan 1000 kali. Pengenceran hingga 1000 kali dilakukan agar ketika dianalisis dengan HPLC diperoleh hasil yang akurat. Hal ini karena sensitivitas HPLC yang tinggi membuat alat HPLC bagus untuk mengukur senyawa dengan konsentrasi yang rendah, dan buruk untuk mengukur senyawa dengan konsentrasi tinggi/ pekat. Konsentrasi yang terlalu tinggi akan menyebabkan terbentuknya interferensi/ gangguan. Contoh pada percobaan ini terjadi pada larutan standar 0,008%. Pada analisis dengan HPLC ini, untuk menentukan konsentrasi asam askorbat dalam sampel digunakan kurva kalibrasi dari larutan standar 0,001%; 0,002%; dan 0,004% yang dibuat dari larutan standar asam askorbat 0,01%. Interferensi yang tejadi pada larutan 0,008% adalah tidak munculnya peak utuh dari standar pada kromatogram dan juga tidak pastinya luas area dari standar 0,008%. Hal ini berarti menunjukkan bahwa konsentrasi 0,008% sudah terlalu tinggi/ pekat untuk dianalisis dengan HPLC yang memiliki sensitivitas tinggi.
Sistem fase yang dilakukan pada percobaan ini adalah fase terbalik. Hal ini karena fase diam yang digunakan adalah C8 (oktadesil) yang bersifat non-polar dan fase gerak adalah asam asetat 6%. Selama proses elusi, asam askorbat akan lebih kuat berinteraksi (berikatan) dengan fasa gerak asam asetat karena sama-sama bersifat polar. Sedangkan interaksi (berikatan) dengan fasa diam akan lemah karena fasa diam C8 (oktadesil) bersifat non-polar. Hal ini akan mempercepat proses elusi asam askorbat dari kolom. Fase diam C8 (oktadesil) juga dapat menarik/ menghambat senyawa non-polar dalan jus jeruk agar terelusi lebih lama, sehingga proses pemisahan lebih baik.
Urutan proses elusi dari sampel adalah pertama fase gerak diletakkan dalam reservoir fase gerak untuk kemudian dialirkan dalam pompa. Dari pompa, fase gerak dialirkan ke injektor sampel dengan tekanan tinggi 1000-2000 psi. Lalu sampel diinjeksi dan didorong lagi melewati kolom dengan tekanan hingga 4000 psi. Penampung sementara dalam HPLC dibuat berbentuk loop dengan tujuan agar sampel terkumpul dan terelusi bersama sehingga didapatkan data puncak yang baik (tidak terputus- putus). Setelah terelusi dari kolom, sampel menuju detektor untuk diukur konsentrasi sampelnya. Detetor yang digunakan pada HPLC umumnya adalah Index Refraktiv (RI), UV-Vis, dan flouresense. Dari detektor data hasil diolah dan ditampilkan dalam bentuk kromatogram.
Hasil kromatogram dapat dibilang bagus karena tidak ada keanehan. Konsentrasi larutan standar naik, luas area dari kromatogramnya juga mengalami peningkatan. Hanya laju pada standar 0,004% puncak kromatogram hampir tidak terlihat dan standar 0,008% dieliminasi karena puncak yang didapat dipastikan tidak tampak di kromatogram karena terlalu pekat konsentrasinya. Berdasarkan pengolahan data dari kromatogram, konsentrasi asam askorbat pada buah jeruk adalah 733,21 mg/100 g buah jeruk. Hasil ini didapat dari perhitungan persamaan kurva standar y= 1.109x + 263398. Bila dibandingkan dengan hasil literatur penelitian, nilai konsentrasi literatur penelitian, nilai kadar asam askorbat adalah 984,00 mg/100 g buah jeruk. Sehingga percobaan cukup mendekati hasil penelitian dari literatur yang didapatkan.
Metode lain yang didapat digunakan untuk menentukan konsentrasi vitamin C adalah titrasi Iodo-Iodimetri. Metode ini memiliki kelebihan lebih mudah dilakukan dan biaya murah. Akan tetapi memiliki ketelitian yang lebih rendah. Selain titrasi juga dapat dilakukan dengan metode voltametri ataupun potensiometri.
V. Kesimpulan
1. HPL dapat digunakan untuk analisis konsentrasi suatu senyawa dengan ketelitian yang tinggi.
2. Konsentrasi vitamin C dalam buah jeruk adalah 753,21 mg/ 100 g buah jeruk
VI. Daftar Pustaka
Aysun, H., 2009, A Overview of Ascorbic Acid Biochemistry, J. Fac. Pharm., 38 (3), 233-255
Crans, D. C., et al., 2008, Impairmentof Ascorbic Acid Antioxidant Properties in Confined Media: Inter and Intramolecular Reaction with Air and Vanadate at Acidic pH, J. Inor. Biochem, Vol. 1334-1337
Dumbrava, D. G., et al., 2012, Comparative Analysis of Vitamin C Content and Antioxidant Activity of Some Fruits Extracts, J. Agro Process and Tech
Hudson, B. J. F., 1990, Food Antioxidants, Elsevier Science Publishers Ltd., England
Kapiet, T., 2004, Quality Control Analytical Method: High Performance Liquid Chromatography, Inter. Jou. Pharm. Compound, Vol. 8, No. 3
VII. Lembar Pengesahan
Yogyakarta, 1 Agustus 2016
Asisten Pembimbing Praktikan
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
VIII. Lampiran
Perhitungan
Diketahui:
Massa Jeruk = 35,88 gram
Volume Jus Jeruk = 21,5 mL
Ditanya:
Konsentrasi Vitamin C pada Jeruk?
Jawab:
y= 1.109x + 263398 (persamaan garis larutan standar)
1520666 = 1.109x + 263398 (dimasukan luas area sampel)
1.109x = 1257268 (dicari konsentrasi sampel)
x = 0,001257% (b/v) (konsentrasi sampel ketika diencerkan 1000 kali)
0,001257 g/100 mL (konsentrasi sampel ketika diencerkan 1000 kali)
0,00001257 g/mL (dikali 1000x dari pengenceran) (Kons. sampel sebelum diencerkan)
0,01257 g/ mL x 21,5 mL (konsentrasi sampel jeruk yang diperoleh dalam 21,5 mL)
0,270255 g AA (konsentrasi sampel jeruk yang diperoleh dalam 21,5 mL)
0,270255 g AA/ 35,88 g Jeruk (konsentrasi sampel jeruk yang diperoleh)
0,0075321 g AA/ 1 g Jeruk (konsentrasi sampel jeruk yang diperoleh dalam 1 gram)
0,75321 g AA/ 100 g Jeruk (konsentrasi sampel jeruk yang diperoleh dalam 100 gram)
753,21 mg AA/ 100 g Jeruk (konsentrasi sampel jeruk yang diperoleh dalam 100 gram)
